terça-feira, 13 de março de 2012

PATOLOGIA/CITOLOGIA

MECANISMOS DA APOPTOSE

Conceitos Iniciais –

    Desde a metade do século dezenove muitas observações por parte dos pesquisadores indicam que há um processo diferenciado nos processos de embriogênese e metamorfose. O termo “morte celular induzida” foi introduzida em 1964, propondo a morte celular não por eventos acidentais mas sim por programação genética da célula. (Lockshin, 2001 // 1964)
    O termo apoptose é derivado do grego com o significado “ser descartado”, em analogia às pétalas de uma flor quando desprendidas. Este processo mostra-se eficaz e necessário para a manutenção das populações celulares. (Leist, 2001)

O Significado do Processo de Morte Celular Programada –

    Durante o desenvolvimento um excesso de células é produzido para formação dos tecidos, no entanto, mecanismos como a morte celular programada atuam como esculpindo o tecido em questão, dando aspecto micro e macroscópico atualmente conhecido por nós. (Meier, 2000). 
    Exemplos fisiológicos importantes no processo de morte celular programada inclui: a separação das pregas interdigitais nas mãos dos embriões (apoptose de tecido mesenquimal) e formação do sistema reprodutor (figura 1) dando ênfase a apoptose que ocorre nos ductos Müllerianos e ductos Wolffianos. (Meier, 2000 // Zuzarte-Luis, 2002). Apoptose é muito relevante na manutenção do equilíbrio entre as respostas imunológicas Th1 e Th2 através das células B e células T bem como a deleção de células malignas: células que sofrem danos irreversíveis aos seus DNAs, sinais mitogênicos inapropriados, células natural killers autoreativas e células infectadas. (Rathmell, 2002).


Figura 1. Apoptose nos órgãos sexuais masculinos e femininos a partir de uma estrutura progenitora (a). Os ductos de Müller e ductos de Wolff são exemplos da apoptose nestas estruturas (b) e (c).

    As deficiências nos processos de apoptose são responsáveis pelas proliferações de células tumorais, sendo responsáveis pelo comprometimento da homeostasia adequada do indivíduo. Ao contrário disso, a exarcebação destes mecanismos apoptóticos levam a condições patológicas graves a serem consideradas (doenças autoimunes de forma geral): doenças neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, Esclerose Amiotrófica Lateral, Esclerose Múltipla dentre muitas outras. (Fadeel, 1999). 
    O mecanismo celular da apoptose é marcado por alterações na permeabilidade celular (transição da permeabilidade mitocondrial) – TPM – onde há formação de um canal de alta condutância com perca do potencial para fosforilação oxidativa; há extravasamento de citocromo c para o meio intracitoplasmático; ativação de uma série de substâncias serino-proteases como caspases (realizam clivagem protéica), transglutaminases (entrecruzamento de proteínas), endonucleases (clivagem nuclear) e fosfatidilserina / trombospondina (marcadores da membrana externa dos corpúsculos apoptóticos com indução da fagocitose). O processo implica na fragmentação da cromatina e das organelas com posterior clivagem das mesmas. Corpúsculos apoptóticos são fagocitados por macrófagos, que reconhecem suas sinalizações. O sistema imunológico não desencadeia uma resposta inflamatória, não havendo lesão de células periféricas (figura 2) (Damiani D, 2004).


Figura 2. Mecanismos gerais da apoptose (Damiani D, 2004).

Mecanismos Envolvidos no Processo Apoptótico: vias de sinalizações –

    Os mecanismos de iniciação do processo de apoptose são eficientemente regulados por uma série de inter-relações de múltiplos fatores. Uma seqüência de sinais extracelulares induzem a morte celular programada como por exemplo, a ligação de fatores em receptores transmembrânicos, defeito no reparo do DNA celular, drogas citotóxicas ou irradiações. 
    Muito do nosso atual conhecimento sobre a apoptose advém de estudos em C. elegans onde uma série de genes foi identificado e atribuído uma função neste complexo mecanismo da apoptose. A apoptose no C. elegans é parcialmente devida a ativação de uma cisteína-protease ced-3 mediada pela sua oligomerização e ativando (em “cascata”) a proteína ced-4. A atividade do complexo ced-3/ced-4 é contra-regulado pelo inibidor da apoptose ced-9 e seu indutor egl-1, ambos membros da família Bcl-2. Estudos em mamíferos e pássaros nos revelaram que o ced-3 é membro da família das cisteínas-proteases, das caspases, e o ced-4 corresponderia ao Apaf-1 (fator ativador de proteases pró-apoptóticos 1), fator determinante na ativação das caspases. 
    As caspases são cisteina proteases, que possuem seus homólogos no C. elegans reconhecido como ced-3, e possuem importância central na sinalização e execução do mecanismo apoptótico. (Bratton, 2000). O termo caspase é proveniente da classificação destas proteases como: protease cisteina dependente aspartato específica, onde sua atividade catalítica depende dos resíduos de cisteína derivados do aspartato. Nos mamíferos 14 tipos diferentes de caspases foram identificadas, até o momento, onde as caspases 11 e 12 foram exclusivamente identificadas em ratos. A caspase 1 é considerada como a enzima de conversão da interleucina 1 beta onde, a exemplo das caspases 4, 5, 11 e 12 mostram ser fundamentais na proteólise e ativação das interleucinas inflamatórias como a pró-IL-1beta e pró-IL-18 (Denault, 2002). 
    Nas células, as caspases são sintetizadas a partir de zimógenos inativos, denominadas pró-caspases. As pró-caspases são proteoliticamente processadas entre subunidades pequenas e grandes resultando em subunidades pequenas e grandes, conseqüentemente. As caspases pró-apoptóticas são divididas em grupos iniciadores da apoptose incluindo caspases 2, 8, 9 e 10 e no grupo de executadores da apoptose, incluindo as caspases 3, 6 e 7. De forma geral as caspases iniciadoras, como a 8 e a 10, possuem domínios longos, contendo domínio efetor de morte (DED) ou domínio de recrutamento de caspases (CARD) como no caso das caspases 9 e 2. A via de morte da apoptose pode ser induzida por vias extrínsecas de estímulos, como ligantes de superfície celular, ou por via intrínseca, com sinais originados no interior da célula. 
    Na via extrínseca da ativação da apoptose a pró-caspase 8 é recrutada pela DED e induzem o sinal de morte através do complexo (DISC), o ligante pode ser o fator de necrose tumoral (TNF). (Figura 3).


Figura 3. Ativação do DISC – Complexo de morte via estímulo extracelular. DD: domínio de morte citoplasmático; DED: adaptador adicional contendo o domínio efetor de morte celular.

A via intrínseca de apoptose envolve a ativação da pró-caspase 9 a qual é ativada por eventos de transição da permeabilidade mitocondrial (TPM) como já discutido anteriormente, com liberação de citocromo c para o meio intracitoplasmático. (Salvesen, 2002b). Neste casos de ativação da caspase 9, há interação com o fator de ativação das proteases pró-apoptóticas 1 (Apaf-1). Uma vez ativada, a caspase 9 ativa uma série de outras pró-caspases como por exemplo a caspase 3, 6 e 7 subseqüentemente, clivando estas pró-caspases em substratos menores, resultando numa amplificação do sinal de morte. (Figura 4). Neste momento poderíamos observar alterações bioquímicas e morfológicas nas células, agora, em apoptose. (Earnshaw, 1999).


Figura 4. A: TPM mitocontrial com liberação de citocromo c e ativação do complexo pró-caspase 9. B: após a ativação do citocromo c e dATP o Apaf-1 auxilia na ativação do processo apoptótico. O aptossomo formado é uma estrutura heptamérica que ativa diretamente os domínios de morte sendo clivado em dímeros.

    A via extrínseca da apoptose é mediada pelos chamados “receptores de morte” os quais encontram-se nas superfícies celulares, transmitindo um sinal de morte para o interior da célula. Receptores de morte incluem o gene da superfamília de receptores para o fator de necrose tumoral (RTNF), incluindo RTNF-1, Fas (CD95), DR-4 e DR-5 (receptores TRAIL). (Ashkenazi, 2002). Todos os membros da família do RTNF consistem em cisteínas ricas em domínios extracelulares, com substancial especificidade, resultando na trimerização e ativação dos seus respectivos receptores de morte. Subseqüentemente o sinal é transduzido para o interior do citoplasma sendo reconhecido pelo domínio de morte do receptor (DD). Moléculas adaptadores do tipo FADD ou TRADD possuem DDs os quais recrutam e ativam os complexos indutores dos domínios de morte, reconhecidos como DISC. Em adição aos DDs, os adaptadores FADD contém os domínios efetores de morte (DED), os quais interagem formando um complexo DED-DED seqüestrando pró-caspases 8 para o complexo DISC. (Figura 3). (Scaffidi, 1998). 
    Num outro tipo celular (tipo II) o sinal vindo ao receptor não ativa as caspases de uma maneira eficaz. Nestes casos o sinal deve ser amplificado pela via apoptótica dependente da mitocôndria. O link de interação entre a mitocôndria e as caspases ocorre através da família das proteínas Bcl-2. Genes pró-apoptóticos como Bax, Bad e Bak induzem a liberação de citocromo c além de outros fatores citossólicos. O citocromo c liga-se ao Apaf-1 o qual, através de alterações conformacionais dependentes de dATP, oligomeriza-se e forma o aptossomo, um complexo que ativará a pró-caspase 9. Esta pró-caspase 9 ativada, desencadeia o sinal para a ativação das caspases 3, 7 e 6 resultando num processo amplificado e catalítico resultando no processo apoptótico. (Slee, 1999). 
    Mitocôndria como regulador central da via intrínseca da apoptose. Ao lado de amplificar e mediar a via extrínseca da apoptose, a mitocôndria funciona como “chave” para a integração e propagação dos sinais de morte originados intrinsicamente por danos ao DNA, por estresse oxidativo, extravasamentos e drogas quimioterápicas. A maior parte dos sinais pró-apoptoticos são derivados da disrruptura mitocondrial originada pela perda do potencial para fosforilação oxidativa – dita TPM – aumentando subitamente a permeabilidade da membrana mitocondrial com formação de um edema com grande influxo de água para a matriz mitocondrial e eventual ruptura da membrana. Proteínas são liberadas para o meio intracitoplasmático (extra-mitocondrial) incluindo proteínas indutoras da apoptose (AIF), endonucleases (endoG), Smac/Diablo, Htr/Omi e o citocromo c, que ativa o aptossomo e, conseqüentemente, a cascata de caspases. A mitocôndria, quando sofre TPM, perde a homeostase bioquímica necessária para sobrevida celular: há depleção de ATP e ausência de síntese, moléculas reduzidas como NADH e NADPH, a glutationa é oxidada e radicais livres são liberados. O feedback desse processo de perca do potencial para fosforilação oxidativa é devido, principalmente, a presença de radicais livres. Na mitocôndria observamos a formação de um poro, um canal de alta condutância que resulta nesse processo apoptótico.

Regulação do Mecanismo Apoptótico –

    Numa célula viável, o sinal apoptótico deve ser mantido “desligado”. No sistema nervoso central temos uma proteína responsável por essa manutenção que designamos como NAIP (proteínas inibidoras da apoptose neuronal). Enquanto não houver um estímulo contundente de morte, com ligação em seus receptores, não haverá apoptose. Estudos nos mostram que todas as células de todas as espécies animais estão prontas para morrerem, isto é, entrarem em apoptose, basta que o estímulo a vida cesse e entre em ação o estímulo de morte. Por esse motivo, a falta de ligantes “pró-sobrevivência” induzem a apoptose, exemplos de ligantes que favorecem o estímulo a vida são ligações de hormônios, fatores de crescimento, citocinas, nutrientes, dentre outros. (Damiani D, 2004 // Ameisen, 2002 // Raff, 1993). 
    Família Bcl-2. A proteína Bcl-2 é um oncogene no qual esta correlacionado ao linfoma folicular e identificado no lócus das imunoglobulinas num cromossomo que sofreu translocação t(14:18), este é o primeiro exemplo de um oncogene que inibe a morte celular e promove a proliferação celular. (Vaux, 1998). 
    Nos mamíferos mais de 30 domínios são descritos na família Bcl-2 onde inúmeros domínios foram identificados como pró-apoptóticos e muitos outros como anti-apoptóticos, mostrando um comportamento dúbio desta proteína no controle da sobrevida celular. (Borner, 2003). A exemplo da Bcl-2, outras proteínas foram identificadas como anti-apoptóticas: Bcl-Xl, Bcl-w, A1 e Mcl-1 as quais possuem domínios BH1, BH2, BH3 e BH4. O grupo pró-apoptótico membros da família Bcl-2 deve ser subdividido: a subfamília Bax consistindo em Bax, Bad, Bak e Bok todas possuindo domínios BH1, BH2 e BH3 necessários para a ativação do mecanismo de morte. (Mund, 2003 // Cory, 2002). 
    Duas linhas de pesquisa são contundentes na determinação da atividade da proteína Bcl-2: uma delas acredita que a Bcl-2 seria a responsável pelo controle direto da atividade das caspases; outra linha de pesquisa acredita que a Bcl-2 seria necessária para a manutenção da integridade mitocondrial. O fato que nos faz acreditar mais na hipótese de que a Bcl-2 seria apenas um conservador da mitocôndria é o fato dela não interagir com o Apaf-1, ela apenas promove a liberação de citocromo c para ai então haver interação e ativação das caspases. (Damiani D, 2004 // Cory, 2002).
    O knockout dos genes Bax e Bak individualmente não alteram a função apoptótica mas o knockout dos dois genes afeta em muito o processo de morte celular programada. A eliminação destes dois genes acarreta num acúmulo de células dramático, principalmente no sistema hematopoético e sistema nervoso central. O Bax constitui-se num monômero em células integras, enquanto que, em células que estão sofrendo apoptose, sofrem conformação, alterando sua expressividade na membrana mitocondrial. Acredita-se que o Bax e o Bak contribuam em muito para a formação dos poros na membrana externa da mitocôndria, desencadeando o processo de TPM. 
    Em contraste, os membros antiapoptóticos da família Bcl-2 seqüestram os fatores pró-apoptóticos com domínios BH3 e impedem a ativação dos genes Bax e Bak, inibindo assim, os eventos pró-apoptóticos mitocondriais: a superexpressão do Bcl-2 ou Bcl-Xl potencialmente inibem a apoptose em resposta a muitos insultos citotóxicos, superexpressão de radicais livres, alterações da permeabilidade mitocondrial e potencial para fosforilações oxidativas, previnindo assim a TPM e liberação de citocromo c. (Reed, 1998). 
    Estudos recentes nos revelam que membros da família Bcl-2 que apresentam somente domínio BH3 são necessários para ativação dos mecanismos pró-apoptóticos com inibições das funções do Bax e Bak. (Bouillet, 2002). Por outro lado, o efeito de morte dos membros da subfamília BH3 dependem da atividade do Bax e Bak já que células que não possuem Bax e Bak, mesmo com superexpressão de BH3 somente, não entram em apoptose. A regulação destes processos e atividades pró-apoptóticas esta na interação entre as proteínas com multidomínios Bax e Bak com os guardiões antiapoptóticos Bcl-2 e Bcl-Kl, onde membros destas famílias com domínios exclusivamente BH3 possuem preferências para ligações aos fatores antiapoptóticos Bcl-2/Bcl-Xl. (Scorrano, 2003). Acredita-se que o domínio individual BH3 faça transdução específica de sinais de morte já que eles ativam os sinais para apoptose desencadeada por estresse, lesão do DNA, ausência de hormônio de crescimento ou mesmo anóxia. (Borner, 2003).
    De forma geral, as proteínas com domínio BH3 exclusivamente, interferem na oligomerização entre membros pró-apoptóticos com múltiplos domínios (Bax e Bak) e membros antiapoptóticos como Bcl-2 e Bcl-Xl. (Figura 5) (Letai, 2002).


Figura 5. Família Bcl-2 e mecanismos de indução a TPM.

    Regulação da apoptose pelo IAP. A superexpressão dos fatores antiapoptóticos como proteínas Bcl-2 ou Bcl-Xl ou mesmo A1, realizam um “up-regulation” do fator transcricional FN-kB o qual é o fator central para adaptação das respostas imunológicas. (Heckman, 2002). Contudo, o FN-kB em algumas circunstâncias contribuem para a apoptose. Além de ativarem a expressão de genes antiapoptóticos como Bcl-2, o NF-kB ativa uma série de genes inibidores das proteínas envolvidas na apoptose denominadas IAPs. Os IAPs são proteínas das famílias antiapoptóticas, nos humanos 8 homólogos foram identificados, além de outros como NAIP (já mencionado), c-IAP1, c-IAP2, XIAP e survivina. Todos os IAPs contém repetições baculovírus (BIR), essenciais para as interações com caspases para exercerem função antiapoptótica. No caso do XIAP, o domínio BIR3 liga-se a uma pequena porção da caspase 9 enquanto que o BIR2 interage com os sítios ativos das caspases 3 e 7. (Huang, 2001 // Srinivasula, 2001). Contudo, não podemos nos esquecer de que os fatores Smac/Diablo liberados na TPM mitocondrial interage com os IAPs inibindo seus efeitos sobre as caspases. (Du, 2000).

    Desregulação do mecanismo apoptótico. Nos indivíduos humanos bilhões de células entram em divisão celular a cada segundo, e um número similar de apoptose também, para que a manutenção da homeostasia seja adequada. Uma desregulação do mecanismo apoptótico leva a uma série de doenças como por exemplo as doenças neurodegenerativas como mal de Alzheimer, doença de Parkinson, Esclerose Múltipla, doença de Huntington, Esclerose Amiotrófica Lateral, doenças auto-imunes, cânceres, AIDS (depleção de linfócitos T) e isquemias. A função alterada do mecanismo de morte esta diretamente relacionada à expressão gênica alterada de fatores envolvidos nas etapas de iniciação, promoção, mediação e execução da apoptose. 
    Pesquisas atuais nos mostram cada vez mais evidências de que a carcinogênese não esta simplesmente no conceito: “multiplicação celular descontrolada” e correlações com oncogenes mas também nos mecanismos promotores (diretos ou indiretos) da apoptose. Muitas alterações favorecem a malignização do tumor, como por exemplo na transformação dos protooncogenes em oncogenes. Uma célula com estas modificações pode ativar proteções contra o mecanismo de apoptose ou inativação de fatores relacionados com a apoptose. O Bcl-2 é superexpresso em uma grande variedade de células cancerosas, contribuindo para a sobrevivência das células cancerosas e realizando inibição direta da apoptose. (Reed, 1999). Mutações nos genes Bax e Bak também são observadas em diversos tipos tumorais. O Bad e a procaspase-9 são negativamente reguladas pelos oncogenes Akt/PKB quinase, promovendo a proliferação celular, tendo na fosfatase PTEN, o efeito antagônico no crescimento tumoral. O oncogene Akt/PKB estimula o fator de crescimento NF-kB pela fosforilação do seu inibidor IkB quinase alfa (IKK a) e também na supressão do p53 (promotor do sinal proapoptótico) pela fosforilação do oncogene Mdm2, que por sua vez, inibe o p53. Tanto o NF-kB e o Mdm2 são superexpressos ou inapropriadamente ativados nos processos de transformações malignas. 
    O p53 mostra-se um importante supressor tumoral protéico o qual é ativado por fatores de transcrição em resposta a hipóxia e especialmente a lesões do DNA, resultando na parada do crescimento ou mesmo na ativação dos mecanismos da apoptose pela estimulação da expressão de alvos do p53 como o p21, Bax, Puma, Noxa, Apaf-1, Fas e DR-5 ou pela supressão da expressão das proteínas antiapoptóticas como Bcl-2, Bcl-Kl e survinina. (Wu, 2001 // Hoffman, 2002). Recentes evidências nos mostram que o p53 interage com o Bcl-Kl promovendo a TPM e liberação do citocromo c. O oncogene Mdm2 é uma ubiquitina ligase que media a ubiquitinação do p53. 
    Em resposta a uma lesão ao DNA, o p53 é fosforilado por uma serina-treonina específica que promove a interação entre o p53-Mdm2 onde o p53 torna-se estabilizado e ativado. Todos os oncogenes ativam os fatores de transcrição E2F-1 o qual não somente promove a progressão e proliferação do ciclo celular mas também são gatilhos para o supressor tumoral ARF (Figura 6 e 7). (Ginsberg, 2002).


Figura 6. Função do p53. A ubiquitinação do p53 pode ser revertida pela enzima de deubiquitinação denominada HAUSP.

    A cascata das caspases e as interações com receptores de membrana celular, bem como os mediadores intrínsecos da apoptose são demonstrados esquematicamente na figura 7.


Figura 7. Interações dos mecanismos apoptóticos – via das caspases, fosforilações e ativações de “domínios de morte” intracelulares.

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